蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位（subcellular localization of a protein）是指蛋白質(zhì)在細(xì)胞結(jié)構(gòu)中具體的定位情況，這對蛋白質(zhì)行使其生物學(xué)功能至關(guān)重要。舉個簡單例子，如果把細(xì)胞想象成一個龐大的企業(yè)，其中細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞膜等對應(yīng)總裁辦、發(fā)電部、門崗等不同的部門，那么只有對應(yīng)的蛋白進(jìn)入正確的「部門」才能使其正常工作，否則便會導(dǎo)致某些疾病發(fā)生，如癌癥、阿爾茲海默病。因此，精準(zhǔn)定位蛋白質(zhì)亞細(xì)胞可以說是生命科學(xué)的核心任務(wù)之一。

盡管科研界已經(jīng)對不同細(xì)胞系中的數(shù)千種蛋白質(zhì)進(jìn)行了空間定位分析，但到目前為止，已測量的蛋白質(zhì)與細(xì)胞系組合數(shù)量還只是其中的冰山一角。比如當(dāng)前最大的亞細(xì)胞定位數(shù)據(jù)集——

人類蛋白質(zhì)圖譜（Human Protein Atlas，HPA），提供了 13,147 個基因編碼的蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位（占已知人類蛋白質(zhì)編碼基因的 65%），但是整個數(shù)據(jù)集包含了 37 個細(xì)胞系，而每種蛋白質(zhì)最多只能在其中三株中進(jìn)行測量。與此同時，主流的實驗手段很難在同一細(xì)胞中同時檢測所有蛋白質(zhì)數(shù)量，這嚴(yán)重阻礙了全面分析復(fù)雜的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，增加了實驗復(fù)雜度和誤差風(fēng)險。

除此之外，蛋白質(zhì)定位并非靜止不變的，它的變異性不僅體現(xiàn)在細(xì)胞系之間，甚至在同一細(xì)胞系的單個細(xì)胞間也會發(fā)生，而現(xiàn)有數(shù)據(jù)圖譜記錄的蛋白質(zhì)和細(xì)胞系對僅反映了特定條件下的結(jié)果。因此，

即便是現(xiàn)有成果也很難直接套用，需要根據(jù)環(huán)境變化而對蛋白質(zhì)定位進(jìn)一步探索。

為了解決蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位技術(shù)方法的局限性和生物系統(tǒng)復(fù)雜性之間的矛盾，機器學(xué)習(xí)被寄予厚望。如今已經(jīng)建模并成功應(yīng)用的如基于蛋白質(zhì)序列的模型、基于細(xì)胞圖像的模型等，雖然在某些方面表現(xiàn)亮眼，但不足之處也十分突出——前者忽視了細(xì)胞類型的特異性定位差異，后者則缺乏推向未知蛋白研究的泛化能力。

有鑒于此，

來自美國麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)的研究團隊提出了一種結(jié)合蛋白質(zhì)序列和細(xì)胞圖像來進(jìn)行未知蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的預(yù)測框架，命名為 Predictions of Unseen Proteins’ Subcellular localization（PUPS）。PUPS 創(chuàng)新地結(jié)合了蛋白質(zhì)語言模型和圖像修復(fù)模型來預(yù)測蛋白質(zhì)定位，使其兼并推向未知蛋白預(yù)測的泛化能力和捕獲細(xì)胞可變性的細(xì)胞類型特定預(yù)測。實驗證明，該框架能夠準(zhǔn)確預(yù)測訓(xùn)練數(shù)據(jù)集之外新實驗中蛋白質(zhì)的定位，具有極佳的泛化能力和高度的準(zhǔn)確性，應(yīng)用潛力突出。

PUPS 技術(shù)研究背景，目標(biāo)及現(xiàn)有數(shù)據(jù)的局限性

研究成果以「Prediction of protein subcellular localization in single cells」為題，已發(fā)表于 Nature Methods。

研究亮點：
* 所提研究創(chuàng)新地結(jié)合了蛋白質(zhì)語言模型和圖像繪制模型，利用蛋白質(zhì)序列和細(xì)胞圖像進(jìn)行蛋白質(zhì)定位預(yù)測，彌補了過往計算模型的不足 

* PUPS 能夠推廣到未知蛋白質(zhì)和細(xì)胞系，從而評估細(xì)胞系之間以及細(xì)胞系內(nèi)單個細(xì)胞間蛋白質(zhì)定位的變異性，并識別與具有可變定位的蛋白質(zhì)相關(guān)的生物過程
* 在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集之外的新實驗中，PUPS 同樣展示了其高度精確的預(yù)測能力，具有突出的應(yīng)用潛力和醫(yī)學(xué)價值

論文地址：

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數(shù)據(jù)集地址：

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數(shù)據(jù)集：以盡可能全面的數(shù)據(jù)打造可信模型

PUPS 的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集來自于人類蛋白質(zhì)圖譜（Human Protein Atlas，HPA），研究團隊將第 16 版 HPA 數(shù)據(jù)匯總到第 22 版當(dāng)中，以盡可能多的收集蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)，確保實驗分析的全面性。如下圖所示：

訓(xùn)練集（綠色），保留集 1 （橙色），保留集 2 （紅色）

HPA 中未采用部分（灰色），HPA 中不包含部分（白色）

具體來說，訓(xùn)練數(shù)據(jù)集包含 340,553 個細(xì)胞數(shù)量，蛋白質(zhì)變體共 8,086 種，對應(yīng) HPA 中 37 種細(xì)胞系中的 2,801 個基因，這些基因名稱以字母 A-G 開頭。另外，訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中還額外包含了 10 個基因，包括 IHO1、IMPAD1、INKA1、ISPD、ITPRID1、KIAA1211L、KIAA1324、LRATD1、SCYL3、TSPAN6。

保留數(shù)據(jù)集分為兩部分：

一部分為保留數(shù)據(jù)集 1，包含 36,552 個細(xì)胞，蛋白質(zhì)變體由 9,472 種構(gòu)成，對應(yīng) 3,312 個基因（含訓(xùn)練集中的 2,801 個），名稱同樣以 A-G 開頭，但來自不同的細(xì)胞系，與訓(xùn)練集無重疊。同時，保留數(shù)據(jù)集 1 進(jìn)一步被拆分為兩個部分，用作評估集和測試集，分別包含 11,050 和 25,502 個細(xì)胞；

保留數(shù)據(jù)集 2 含有 24,007 個細(xì)胞，對應(yīng) 515 個基因，其名稱以字母表所有字母開頭，即涵蓋 A-Z，蛋白質(zhì)變體共 556 種，來自完全未在訓(xùn)練集和保留數(shù)據(jù)集 1 中出現(xiàn)的新基因家族，可用于模型泛化能力的測試。

另需說明的是，BJ 細(xì)胞系圖像被同時保留在了訓(xùn)練集和保留數(shù)據(jù)集 1 中。

在實驗之前，研究團隊對 HPA 中的圖像進(jìn)行了預(yù)處理，簡單來說包含以下 5 步：

* 第一步，對每張圖像向下采樣 4 次，最終分辨率降至 0.32 μm/像素，以便減少計算量并去除高頻噪聲；

* 第二步，結(jié)合高斯模糊（σ=5）和 Otsu 閾值法從復(fù)雜背景中分離出細(xì)胞核的大致區(qū)域；

* 第三步，使用 remove_small_holes 函數(shù)，移除面積小于 300 像素的孔洞，然后將圖像二值化，并去除小于 100 像素的噪聲區(qū)域；

* 第四步，計算每個細(xì)胞核的質(zhì)心，并以質(zhì)心為中心，裁剪出 128 x 128 像素的區(qū)域作為單個細(xì)胞的 ROI；

* 第五步，通過強度歸一化和噪聲過濾，實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)分布，減少通道間干擾。

模型架構(gòu)：結(jié)合蛋白質(zhì)序列和圖像表征預(yù)測蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位

PUPS 模型主要由兩個部分組成，

一個用于從蛋白質(zhì)的氨基酸序列中學(xué)習(xí)序列表示；另一個用于從靶細(xì)胞的標(biāo)志性染色中學(xué)習(xí)圖像表示，然后結(jié)合蛋白質(zhì)序列表示和圖像表示來預(yù)測蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。前者使模型能夠推廣到未知蛋白質(zhì)預(yù)測，后者使模型具備捕獲單細(xì)胞水平的變異性，實現(xiàn)了細(xì)胞類型特異的定位預(yù)測。如下圖所示：

未知細(xì)胞系中未知蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位演示

簡單來說，

PUPS 利用了預(yù)訓(xùn)練的 ESM-2（Evolutionary Scale Modeling）蛋白質(zhì)語言模型提取蛋白序列特征，同時用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)細(xì)胞的標(biāo)志性染色圖像特征，最終結(jié)合兩部分信息預(yù)測蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的定位。需要說明的是，模型所有部分同時進(jìn)行訓(xùn)練，有助于減少前置任務(wù)的分類損失，以及預(yù)測蛋白質(zhì)圖像與 HPA 中實驗測量的蛋白質(zhì)圖像之間的差異。所有參數(shù)使用 Adam 優(yōu)化器進(jìn)行優(yōu)化，學(xué)習(xí)率為 1e-4。

蛋白質(zhì)語言模型

PUPS 通過使用語言模型、自注意力層以及一個輔助預(yù)訓(xùn)練任務(wù)來學(xué)習(xí)序列表征，然后根據(jù)學(xué)習(xí)到的序列表征對蛋白質(zhì)定位進(jìn)行分類。

具體來說，研究團隊通過將 N 端 2,000 個氨基酸序列輸入到預(yù)訓(xùn)練 ESM-2 模型中，獲得特定蛋白質(zhì)變體的初始表示，從而為每個氨基酸殘基生成 1,280 維向量，殘基少于 2,000 的變體采用零填充。這種序列長度截斷是為了避免對序列長度高達(dá)數(shù)萬個殘基的少數(shù)蛋白質(zhì)進(jìn)行偏倚預(yù)測。如下圖所示：

基于預(yù)訓(xùn)練 ESM-2 模型與輕量注意力層的蛋白質(zhì)序列表征學(xué)習(xí)模型架構(gòu)

為了使 ESM-2 表征適應(yīng)于蛋白質(zhì)定位預(yù)測，

團隊在后續(xù)采用了可分離卷積（separable convolutions）的輕注意力層，應(yīng)用于 ESM-2 表示最終獲得 300 維序列表征。這種蛋白質(zhì)序列表示既用于預(yù)測定位標(biāo)簽的輔助前置任務(wù)，同時也用于與圖像表示相結(jié)合的蛋白質(zhì)圖像預(yù)測。前置任務(wù)將蛋白質(zhì)序列表示輸入到一個全連接的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)層，以輸入一個 29 維向量，表示 29 個亞細(xì)胞區(qū)室定位標(biāo)簽中的概率分布，然后利用 S 型激活（sigmoid activation）的二元交叉熵?fù)p失將前置任務(wù)輸出結(jié)果與 HPA 注釋的蛋白區(qū)室進(jìn)行比較。

圖像繪制模型

每個細(xì)胞的圖像輸入包含了細(xì)胞核、微管和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色這 3 個標(biāo)志性染色圖像通道，其維度為 3 x 128 x 128，并以細(xì)胞核質(zhì)心為中心。

圖像編碼通過 5 個可分離卷積層實現(xiàn)，最終維度 16 x 16 x 512。每個卷積層之后依次連接 leakyRelu 激活，批歸一化以及 2D 最大池化層。蛋白質(zhì)序列表示被拼接至細(xì)胞圖像表示的所有空間維度，隨后輸入 U-Net 圖像解碼器，為每個輸入通道學(xué)習(xí)不同權(quán)重。此外，模型中的空間維度加權(quán)機制允許圖像表征的每個空間維度以不同權(quán)重與序列表征相結(jié)合。

解碼器由 5 個可分離卷積層構(gòu)成，生成 1 x 128 x 128 的圖像輸出，即對應(yīng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)圖像預(yù)測。然后將類似于圖像分割 U-Net 的跳躍連接（skip connentions）添加在標(biāo)志染色生成圖像表示的編碼層與同深度生成蛋白質(zhì)圖像預(yù)測的解碼層之間。研究采用了均方誤差損失函數(shù)訓(xùn)練模型，以最小化預(yù)測蛋白質(zhì)圖像與實驗測量蛋白質(zhì)圖像之間的差異。

實驗結(jié)果：實現(xiàn)單細(xì)胞級蛋白質(zhì)亞細(xì)胞精準(zhǔn)定位

為了驗證模型的可行性和有效性，研究團隊提出多項實驗進(jìn)行驗證，PUPS 在多項任務(wù)中均表現(xiàn)出較好的性能，凸顯了其多模型融合的優(yōu)勢。

預(yù)測細(xì)胞系間蛋白質(zhì)定位的變異性

為了評估 PUPS 在定量分析蛋白質(zhì)于細(xì)胞系間定位變異性方面的性能，

研究團隊通過計算蛋白質(zhì)核內(nèi)比例量化定位變異性，發(fā)現(xiàn)預(yù)測值與真實數(shù)據(jù)高度相關(guān)，Holdout 1 的 pearson 相關(guān)系數(shù)為 0.794，Holdout 2 的 pearson 相關(guān)系數(shù)為 0.878。如下圖所示：

PUPS 精準(zhǔn)預(yù)測不同細(xì)胞系間蛋白質(zhì)定位的差異

隨后進(jìn)一步分析顯示，細(xì)胞系間定位變化最大的蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分化和染色質(zhì)調(diào)節(jié)等生物過程相關(guān)，如 ATP13A5 的實驗驗證證實了模型預(yù)測的準(zhǔn)確性。此外，

模型通過標(biāo)志性染色捕捉細(xì)胞形態(tài)差異，無需細(xì)胞系標(biāo)簽即可推斷蛋白質(zhì)定位的細(xì)胞系特異性，為研究蛋白質(zhì)功能的細(xì)胞特異性調(diào)控提供了新方法。

預(yù)測單細(xì)胞間蛋白質(zhì)定位的差異性

為了評估 PUPS 對同一細(xì)胞系內(nèi)單細(xì)胞間蛋白質(zhì)定位變異性的預(yù)測能力，研究團隊計算了每個細(xì)胞系中所有單細(xì)胞中蛋白質(zhì)的核內(nèi)比例方差，

結(jié)果發(fā)現(xiàn)每種蛋白與細(xì)胞系對的單細(xì)胞變異性預(yù)測排名與真實數(shù)據(jù)高度一致，如 Holdout 2 中前 500 個高變異對重疊率超過了 60%，并且預(yù)測的核內(nèi)比例分布與實際結(jié)果一致，排除了預(yù)測誤差影響。

PUPS 可預(yù)測細(xì)胞系內(nèi)單細(xì)胞中蛋白質(zhì)定位的可變性

另外 Gene ontology（GO）分析表明，高度可變的蛋白質(zhì)與細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)錄、雙鏈斷裂修復(fù)以及凋亡等過程有關(guān)。此外，

模型通過細(xì)胞標(biāo)志性染色圖像捕捉形態(tài)等特征，表明了單細(xì)胞變異性不僅具有隨機性，還與細(xì)胞形態(tài)特征相關(guān)，為解釋單細(xì)胞異質(zhì)性機制提供了新視角。

PUPS 在訓(xùn)練數(shù)據(jù)之外的新實驗中的驗證

為了驗證 PUPS 在新的實驗環(huán)境下預(yù)測蛋白質(zhì)定位的泛化能力，研究團隊選擇了 9 種蛋白質(zhì)在 5 個細(xì)胞系中進(jìn)行驗證。如下圖所示：

PUPS 在 HPA 之外的實驗中預(yù)測蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的能力

ATP13A5、CHID1、COPA、MESD 和 RBM23 為細(xì)胞系間變異最大的蛋白，它們都有不同的 GO term；DDIT3 和 N4BP2 是細(xì)胞系內(nèi)單個細(xì)胞中變異最大的蛋白；EIF4G1 和 PSME3IP1 是細(xì)胞系間變異最小的蛋白，前者預(yù)計主要位于細(xì)胞核外，后者預(yù)計主要位于細(xì)胞核內(nèi)。5 個細(xì)胞系中，除 A375 外，其他 HeLa、MCF7、GAMG 和 HEK293FT 均包含在 HPA 中。

結(jié)果顯示，

PUPS 預(yù)測的蛋白質(zhì)圖像在視覺上與實驗測量的圖像相似。利用預(yù)測蛋白圖像計算的每個單細(xì)胞的核蛋白比例與實驗測量圖像計算的比例密切相關(guān)，pearson 相關(guān)系數(shù)為 0.767。這表明，

PUPS 可以用于定量預(yù)測以前沒有實驗測量或在訓(xùn)練圖譜中使用的蛋白質(zhì)的定位。

PUPS 學(xué)習(xí)到有意義的蛋白質(zhì)和細(xì)胞表征

實驗證明，PUPS 在未知蛋白質(zhì)和細(xì)胞系中預(yù)測蛋白質(zhì)定位的能力來自于學(xué)習(xí)到了蛋白質(zhì)序列和細(xì)胞標(biāo)志性圖像的有意義表示。

研究團隊繪制了對應(yīng)于 12,614 個基因的 40,622 個蛋白質(zhì)形態(tài)的蛋白質(zhì)序列表示，具有相似定位的蛋白質(zhì)往往具有相似的序列表示。為進(jìn)一步證明模型能識別有意義的蛋白質(zhì)序列模式以及預(yù)測定位，研究團隊使用 Positional Shapley 方法計算了特定蛋白質(zhì)中每個氨基酸殘基對預(yù)測各細(xì)胞區(qū)室標(biāo)簽預(yù)測的重要性，如成功解釋了 N4BP2 核定位的預(yù)測變異性，也與 CUE 結(jié)構(gòu)域通泛素結(jié)合可能改變亞細(xì)胞定位的報道相符。

PUPS學(xué)習(xí)有意義的蛋白質(zhì)和細(xì)胞表征

除此了識別有意義的蛋白質(zhì)序列基序外，

研究團隊進(jìn)一步表明了 PUPS 從細(xì)胞標(biāo)志性染色中學(xué)習(xí)單細(xì)胞的有意義表征。其將從標(biāo)志性染色中學(xué)習(xí)到的單細(xì)胞圖像表示可視化，發(fā)現(xiàn)即使細(xì)胞系標(biāo)簽沒有輸入到模型當(dāng)中，同一細(xì)胞系的單細(xì)胞也具有相似的圖像表示。蛋白質(zhì)和細(xì)胞標(biāo)志性圖像的聯(lián)合表示保留了細(xì)胞系和蛋白質(zhì)之間的分離，而每個細(xì)胞系內(nèi)的不同蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞系之間的順序相似。給定聯(lián)合表示空間中每個細(xì)胞系的質(zhì)心，從質(zhì)心到特定蛋白質(zhì)的向量在所有細(xì)胞系中大部分是平行的，即在給定序列表示的情況下，預(yù)測特定蛋白質(zhì)的圖像需要再表示空間中以相同方向移動，而不管細(xì)胞系是什么，

這解釋了 PUPS 通過學(xué)習(xí)有意義的蛋白質(zhì)和細(xì)胞圖像表示來推廣到未知蛋白質(zhì)和細(xì)胞系的能力。

此外，

PUPS 還能預(yù)測致病突變對蛋白質(zhì)定位的影響。例如，針對核編碼的線粒體蛋白 SDHD 和 ETHE1 的突變研究表明，SDHD 突變會導(dǎo)致其核定位比例增加，這與疾病中核基因組不穩(wěn)定的機制一致；ETHE1 突變則顯示胞質(zhì)定位比例升高，與已知的核 - 胞質(zhì)穿梭異常相關(guān)。這些結(jié)果表明，PUPS 可通過分析序列變異對定位的影響，為疾病機制研究提供新線索。

蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測新解

正如上述所言，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測在生物信息學(xué)和生物學(xué)研究中都具有重大意義，PUPS 提供了一種融合多模態(tài)信息的思路，為該領(lǐng)域的研究畫上了濃墨重彩的一筆。與此同時，該領(lǐng)域的研究經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，其成果也早已是百花齊放。

愛爾蘭都柏林大學(xué)的團隊在 Computational and Structural Biotechology Journal 雜志上發(fā)表了一項研究，

其中圍繞蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測介紹了多種計算方法，包括基于序列、注釋、混合及元預(yù)測等類別，同時文章還按真核生物、原核生物、病毒及多類別對亞細(xì)胞定位預(yù)測工具進(jìn)行了分類介紹，真核生物預(yù)測工具如 mLASSO-Hum、DeepPSL 等，原核生物預(yù)測工具如 PRED-LIPO 等。通過設(shè)計涵蓋 7 個主要領(lǐng)域及 28 個子分類的機器學(xué)習(xí)和深度學(xué)習(xí)分類圖，該研究提供了單類別和多類別預(yù)測工具分類法，從而方便用戶查找方法、預(yù)測工具。論文以「Protein subcellular localization prediction tools」發(fā)表。

* 論文地址：

??https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2001037024001156??

復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院楊力研究組與上海人工智能實驗室董楠卿研究組合作，于 4 月 12 日在 Briefings in Bioinformatics 雜志在線發(fā)表了題為「Deep Generative Model for Protein Subcellular Localization」的研究論文。

研究同樣基于 ESM2 蛋白質(zhì)大語言模型及 U-Net 框架，開發(fā)了具備多模態(tài)處理能力的生成式深度學(xué)習(xí)模型 deepGPS。

據(jù)介紹，deepGPS 能夠接收蛋白質(zhì)序列及細(xì)胞核圖像作為輸入，并生成蛋白質(zhì)定位的文本標(biāo)簽及分布圖像，是一種支持蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測的新型「文生圖」（text-to-image）多模態(tài)模型。
* 論文地址：

隨著人工智能與生物學(xué)研究的融合加速，相關(guān)的創(chuàng)新性實驗也在不斷涌現(xiàn)，并逐漸打破傳統(tǒng)方法的弊端，實現(xiàn)「兩全其美」甚至「十全十美」的表現(xiàn)，從而推動生物信息學(xué)的快速發(fā)展。